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酶联免疫吸附试验操作时都有哪些注意要点

2019-04-11

    做实验对许多人来说都是不生疏的,毕竟许多人在读高中的时分会常常做各种实验。而现在许多时分想要得到自己的数据,就需要不停的做运用。酶联免疫吸附实验也是常常做的,虽然简略,但是操作的时分也不能大意。下面就来介绍一下酶联免疫吸附实验操作时都有哪些留意要点?

    1 标本的采取和保存

    可用作elisa测定的标本非常广泛,体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、粪便)等均可作标本以测定其间某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定(如血清、尿液),有些则需经预处理(如粪便和某些分泌物)。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂,而血清标本只需待血清天然凝结、血kuai收缩后即可获得。除特殊情况外,在医学查验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等运用。血清标本可按惯例办法收集,应留意防止溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为符号的ELISA测定中,溶血标本或许会增加非特异性显色。 血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染,菌体中或许含有内源性HRP,也会发作假阳性反响。如在冰箱中保存过久,其间的可发作聚合,在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,超过一周测定的需低温冰存。冻住血清融解后,蛋白质部分浓缩,散布不均,应充沛混匀宜轻缓,防止气泡,可上下颠倒混和,不要在混匀器上强烈振动。混浊或有沉积的血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。重复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测,宜少数分装冰存。保存血清自收集时就应留意无菌操作,也可参加适当防腐剂。

    2 试剂的预备

    按试剂盒说明书的要求预备实验中需用的试剂。ELISA顶用的蒸馏水或去离子水,包含用于洗涤的,应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液运用pH计测量较正。从冰箱中取出的实验用试剂应待温度与室温平衡后运用。试剂盒中本次实验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

    3 加样

    在ELISA中一般有3次加样步聚,即加标本,加酶结合物,加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部,防止加在孔壁上部,并留意不行溅出,不行发作气泡。 加标本一般用微量加样器,按规则的量参加板孔中。每次加标本应更换吸嘴,以免发作穿插污染,也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定(如间接法ELISA)需用稀释的血清,可在试管中按规则的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中参加稀释液,再在其间参加血清标本,然后在微型震动器上震动1分钟以确保混和。加酶结合物运用液和底物运用液时可用定量多道加液器,使加液进程敏捷完结。

    4 保温

    在ELISA中一般有两次抗原抗体反响,即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反响的完结需要有必定的温度和时刻,这一保温进程称为温育(incubation),有人称之为孵育,在ELISA中似不恰当。 ELISA属固相免疫测定,抗原、抗体的结合只在固相表面上发作。以抗体包被的夹心法为例,参加板孔中的标本,其间的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的时机,只有靠近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的进程,因而需经分散才能到达反响的终点。在其后参加的酶符号抗体与固相抗原的结合也同样如此。这便是为什么ELISA反响总是需要必定时刻的温育。

    温育常选用的温度有43℃、37℃、室温文4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室中常用的保温温度,也是大多数抗原抗体结合的适宜温度。在树立ELISA办法作反响动力学研究时,实验标明,两次抗原抗体反响一般在37℃经1-2小时,产物的生成可达高峰。为加快反响,可进步反响的温度,有些实验在43℃进行,但不宜选用更高的温度。抗原抗体反响4℃更为彻底,在放射免疫测定中多使反响在冰箱中过夜,以形成较多的沉积。但因所需时刻太长,在ELISA中一般不予选用。

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