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人尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)ELISA试剂盒的详细资料

产品中文名称:人尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)ELISA试剂盒
产品英文名称;Human urokinase plasminogen activator,uPA ELISA kit
产品包装:96T/48
CAS号:
本公司产品仅供科研使用,信誉*,品质保障。 咨询产品“人尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)ELISA试剂盒”详细说明 。

试验原理

u-PA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA.已知u-PA浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将u-PA和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后,加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物AB,和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中u-PA的浓度呈比例关系。

 

试剂盒内容及其配制

试剂盒成份(2-8℃保存)

96孔配置

48孔配置

配制

96/48人份酶标板

1块板(96T

半块板(48T

即用型

塑料膜板盖

1

半块

即用型

标准品:8.0ng/ml

1瓶(0.6ml

1瓶(0.3ml

按说明书进行稀稀

空白对照

1瓶(1.0ml

1瓶(0.5ml

即用型

标准品稀释缓冲液

1瓶(5ml

1瓶(2.5ml

即用型

生物素标记的抗u-PA抗体

1瓶(6ml

1瓶(3.0ml

即用型

亲和链酶素-HRP

1瓶(10ml

1瓶(5.0ml

即用型

洗涤缓冲液

1瓶(20ml

1瓶(10ml

按说明书进行稀释

底物A

1瓶(6.0ml

1瓶(3.0ml

即用型

底物B

1瓶(6.0ml

1瓶(3.0ml

即用型

终止液

1瓶(6.0ml

1瓶(3.0ml

即用型

标本稀释液

1瓶(12ml

1瓶(6.0ml

即用型

 

自备材料

1.     蒸馏水。

2.     加样器:5ul10ul50ul100ul200500ul1000ul

3.     振荡器及磁力搅拌器等。

 

安全性

1.     避免直接接触终止液和底物AB。一旦接触到这些液体,请尽快用水冲洗。

2.     实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。

3.     不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

 

操作注意事项

1.     试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。

2.     实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。

3.     不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

4.     使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物AB液时,避免使用带金属部分的加样器。

5.     使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

6.     洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

7.     底物A应挥发,避免长时间打开盖子。底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。避免用手接触,有毒。实验完成后应立即读取OD值。

8.     加入试剂的顺序应*,以保证所有反应板孔温育的时间一样。

9.     按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

 

样品收集、处理及保存方法

1、     血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后,1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2、     血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

3、     细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4、     组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟,取上清液

5、     保存------如果样品不立即使用,应将其分成小部分-70 ℃保存,避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒,检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

 

试剂的准备

1.     标准品:标准品的系列稀释应在实验时准备,不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行:

8.0 ng/ml

6号标准品)

原倍浓度不用稀释直接加入50ul

4.0 ng/ml

5号标准品)

100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液

2.0 ng/ml

4号标准品)

100ul5号标准品加入100ul的标准品稀释液

1.0 ng/ml

3号标准品)

100ul4号标准品加入100ul的标准品稀释液

0.5 ng/ml

2号标准品)

100ul3号标准品加入100ul的标准品稀释液

0.25 ng/ml

1号标准品)

100ul2号标准品加入100ul的标准品稀释液

0 ng/ml

(空白对照)

原始浓度不用稀释直接加入50ul

 

2.     洗涤缓冲液(50×)的稀释:蒸馏水50倍稀释。

 

 

操作步骤

1.     使用前,将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫,以免加样时加入大量的气泡,产生加样上的误差。

2.     根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液11稀释后加入50ul于反应孔内。

3.     加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃温育1小时。

4.     甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。

5.     每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃温育30分钟。

6.     甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。

7.     每孔加入底物AB50ul,轻轻振荡混匀,37℃温育10分钟。避免光照。

8.     取出酶标板,迅速加入50ul终止液,加入终止液后应立即测定结果。

9.     450nm波长处测定各孔的OD值。

 

建议使用的实验方案

 

标准品浓度(ng/ml

 

A

8.0

8.0

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

B

4.0

4.0

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

C

2.0

2.0

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

D

1.0

1.0

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

E

0.5

0.5

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

F

0.25

0.25

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

G

0

0

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

H

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

 

 

局限

6号标准品以上的结果为非线性的,根据此标准曲线无法得到精确的结果。

 

试剂盒性能

1. 灵敏度:zui小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990

2. 特异性:不与人其它细胞因子反应。

3. 重复性:板内、板间变异系数均小于10%

 

结果 判 断

1、仪器值:于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD

 

2、以吸光度OD值为纵坐标(Y),相应的u-PA标准品浓度为横坐标(X),做得相应的曲线,样品的u-PA含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

 

3检测值范围:0-8.0ng/ml

 

4、敏感度: 0.01 ng/ml

 

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